ZEISS LSM 980 with Airyscan 2

高速マルチプレックスモードによる次世代共焦点顕微鏡

3D培養、スフェロイド、オルガノイド、または個体全体などの生物モデルに対して、その生命現象をできるだけ妨げずに観察するには、標識濃度を低く抑える必要があります。また、低い光毒性と高速性を兼ね備えた光学セクショニング3Dイメージングが必要です。そして結論を導き出すには、実験を繰り返し、統計的に有効なデータを得なければならず、そのためにはハイスループットが欠かせません。

LSM 980 with Airyscan 2は、共焦点4Dイメージングに最適なプラットフォームであり、高効率で複数の微弱な標識シグナル(最長で900 nmの波長まで)を同時に分光検出し、かつシグナルロスを極限まで抑えるように最適化されています。マルチプレックスモードを備えたAiryscan 2により、イメージングのオプションが増えて実験の幅が広がるとともに、 より広い視野を超解像で、低ダメージかつ高速にイメージングすることができます。そして、ソフトウェアのヘルプツールがワークフローを最適化し、効率的なイメージングとデータ管理をサポートします。

ZEISS LSM 980 with Airyscan 2

特長

多様な研究に対応する高度なイメージング

  • 380 nm~900 nmまでの豊富な蛍光標識色素に対応。
  • 最大36チャンネル同時検出可能、スペクトルの柔軟性を実現。
  • Airyscan 2のマルチプレックスモードで短時間でより多くの情報を取得。
  • AI Sample Finderにより、関心領域を素早く見つけてイメージングを実行。
  • Smart Setupによる最適なイメージングと検出器の設定。
  • NLO、NIR、Cryo、SIM²イメージングで広がる研究の幅。

より良いデータをより速く

Airyscan 2のマルチプレックスモードで、短時間でより多くの情報を取得しましょう。スマートな照明と検出方式が、回折限界を超えて高いフレームレートで困難な3D試料をイメージングし、繊細な試料であってもダメージを最小限に抑えます。また、柔軟性の高いポイントスキャン共焦点と、高速で低ダメージ、高感度のAiryscanのエリア検出器を組み合わせることで、超解像で最大10倍も速くデータを取得することが可能になりました。

画像:DNA(青、Hoechst 44432)、微小管(黄、anti-tubulin Alexa 488)およびF-アクチン(マゼンタ、phalloidin-Abberior STAR Red)で染色したHeLa細胞。ZEISS Airyscan 2マルチプレックスモードでのイメージング。広い視野で効率的な超解像イメージングが可能に。ご提供:A. Politi, J. Jakobi and P. Lenart, MPI for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany

DNA(青、Hoechst 44432)、微小管(黄、anti-tubulin Alexa 488)およびF-アクチン(マゼンタ、phalloidin-Abberior STAR Red)で染色したHeLa細胞
HeLa細胞
Cos-7細胞、DAPI(青)およびAnti-Tubulin Alexa 700(赤)。NIR検出器でイメージングされたAlexa 700。
Cos-7細胞

より高感度の画像

LSM 980は、イメージングが極めて難しい試料に対してもそのメリットを発揮します。最大36チャンネル同時検出可能なLSM 9シリーズの光効率に優れたビームパスが近赤外(NIR)領域までのスペクトルの柔軟性を実現します。加えて、Airyscan 2と組み合わせると、この革新的なエリア検出器で試料からさらに多くの情報を短時間で取得可能になります。Airyscan 2では、分解能を高めるためにピンホールを閉じる必要はなく、光効率がより向上します。これにより微弱なシグナルも4~8倍高いS/N比で3Dイメージングすることができます。

画像:Cos-7細胞、DAPI(青)、Anti-Tubulin Alexa 700(赤)。Alexa700はNIR検出器を用いて取得。試料ご提供:Urs Ziegler and Jana Doehner, University of Zurich, ZMB, Switzerland

生産性の向上

複雑な生細胞イメージング実験がかつてないほど簡単になりました。ZENソフトウェアは、再現性のある結果を可能な限り短時間で得るための豊富な支援機能を備えています。

AI Sample Finderが関心領域を素早く見つけてイメージングを行うため、データの取得により多くの時間をかけることができます。また、Smart Setupが蛍光標識に最適なイメージング設定をサポートし、 Direct Processing機能でデータの取得と処理が同時に行えます。さらにZEN Connectでは、イメージング中もその後も、常に実験の全体の流れを把握・共有することができます。

ZEN BioApp:美しい画像を価値あるデータへ - 画像を効率的に解析
ZEN BioApp:美しい画像を価値あるデータへ - 画像を効率的に解析

Airyscanの原理

Airyscanの原理

従来の共焦点レーザー走査型顕微鏡は、ポイントで照射して、試料を連続でスキャンします。顕微鏡光学系によって、各ポイントの情報は広がりのあるエアリーディスク(エアリーパターン)に変換されます。その後、ピンホールがこのエアリーディスクを空間的に制限し、焦点外の光が検出器に到達するのをブロックします。ピンホールを閉じることで高分解能を実現できますが、代償として検出される光子は少なくなります。こうした失われた光子はデコンボリューションなどで回復することはできません。

Airyscan 2は、同心円状に配置された32個の検出エレメントからなるエリア検出器であり、 より多くのエアリーディスクを一度に取得できます。共焦点ピンホール自体は開いており、光をブロックしないため、より多くの光子を検出することができ、 イメージング中の集光率が大幅に向上します。こうしてAiryscan 2は、高感度でダメージの少ない超解像イメージングを実現します。

Airyscan 2の新しいマルチプレックスモードのしくみ

ZEISSのAiryscan 2を搭載したLSM 9シリーズは、実験のニーズに合わせたイメージング速度と解像度の選択肢を広げます。共焦点エリア検出器と高性能な照明および読み出し方式を組み合わせることで、様々なオプションから選択できます。新たなマルチプレックスモードでは、励起レーザースポットの形状と、それぞれのエリア検出器エレメントの位置に関する情報から、ピクセルを並列で読み出している間にもより多くの空間情報を取得可能です。視野全体をスキャンするときにより大きな幅でスキャンできるため、取得速度が向上します。

実際、ピンホール面で得られた多くの空間情報から、取得時よりも高い解像度で最終画像を再構成できます。Airyscan 2のマルチプレックスモードでは、一度のスキャンで最大4ラインの超解像画像情報を高いSN比で取得可能です。さらに、LSM 980 with Airyscan 2では、励起レーザースポットを引き伸ばして8ラインを同時にイメージングできます。このハイスピード性能によって、シングルスライスの超高速タイムシリーズ、広い領域の高速タイリング、および高速4Dイメージングが可能になります。

マルチプレックスモードのアニメーション動画を見る

LSM 980 Airyscan SR マルチプレックスSR-4Y マルチプレックスSR-8Y マルチプレックスCO-8Y
並列処理

1

4

8

8

X/Y分解能 (nm)

120/120

140/140

120/160

共焦点もしくはそれ以上

最大視野での最大fps

0.2(ズーム1.7)

1.0(ズーム1)

2.0(ズーム1)

9.6(ズーム1)

抗体標識、微細構造の検出

+++++

++++

+++

++

抗体標識、タイリング

++

++++

++++

+++

生細胞イメージング

++

+++

++++

+++++

近赤外(NIR)イメージング

スペクトル領域の拡大

スペクトル領域を近赤外(NIR)に広げることで、より多くの標識を並行して使用することができます。Quasar検出器とNIR検出器は、それぞれ高い感度を持つ波長帯域を効率的にカバーし、マルチカラー実験において、より多くの色素で様々な構造を可視化します。NIR蛍光標識は波長が長いため、生体試料に対する光毒性が低減され、 光の影響を抑えながら試料をより長く観察できます。また、長い波長域の光は試料組織による散乱が少なく、組織深部への透過率が高くなります。

2チャンネルのNIR検出器は、2つの異なる検出器技術(extended red GaAsPとGaAs)を組み合わせ、900 nmまでの最適な感度を実現します。

NIRを含むZEISS LSM 980検出器の典型的なスペクトル量子効率(QE)
NIRを含むZEISS LSM 980検出器の典型的なスペクトル量子効率(QE)
Cos-7細胞、DAPI(マゼンタ)、Anti-tubulin Alexa 568(青)、アクチンPhalloidin-OG488(黄)、Tom20-Alexa 750(赤)。

Cos-7細胞、DAPI(マゼンタ)、Anti-tubulin Alexa 568(青)、アクチンPhalloidin-OG488(黄)、Tom20-Alexa 750(赤)。Lambdaモードで可視・近赤外(NIR)のスペクトルをイメージング。Linear Unmixingにより個々のシグナルを分離。Zスタックの最大強度投影。
試料ご提供:Urs Ziegler and Jana Doehner, University of Zurich, ZMB, Switzerland

Cos-7細胞の微小管(Anti-Tubulin AF700)。ZEISS LSM 980 MA-PMT(左)とZEISS NIR GaAsP検出器(右)の比較。同じ出力で639 nmのレーザーで励起。MA-PMTの検出波長範囲は660~757 nm、NIR検出器の検出波長範囲は660~900 nmに設定。
試料ご提供:Urs Ziegler and Jana Doehner, University of Zurich, ZMB, Switzerland

LSM 980 NLOと多光子顕微鏡

多光子顕微鏡法(二光子顕微鏡法、非線形光学(NLO)顕微鏡法)は、生体(in vivoおよびin vitro)または固定された試料の非侵襲的かつ深部組織のイメージングに適した方法として確立されており、特に神経科学のイメージングに革命をもたらしました。多光子顕微鏡法は、長波長(600~1300 nm)の光が組織での吸収や散乱が少なく、試料の深部まで到達しながら焦点を結ぶことができるという特性を利用しています。蛍光色素を励起するために必要なエネルギーは、1つの光子ではなく、半分のエネルギーを持つ2つの光子によってもたらされます。2つの光子が同時に蛍光分子に吸収される確率は、光子密度の高い焦点位置でのみ十分となります。そのため、すべての蛍光は焦点面から発生し、効率的に検出され、ピンホールを使わずとも光学セクションを生成することができます。

二光子顕微鏡のエネルギー図
二光子顕微鏡のエネルギー図
共焦点顕微鏡と多光子顕微鏡の組み合わせ

共焦点機能と多光子機能を有するLSMでは、実験に最適な方法で両方の技術を活用できます。

  • 深部組織への浸透と感度、解像度、速度を同時に向上。
  • 露光を減らし、すべての蛍光シグナルを明確に分離。
  • 高感度のGaAsP NDD検出器をサンプルに近づけて効率的にシグナルを収集。
  • 非染色の構造でも、多光子励起による第二または第三高調波(SHG、THG)でイメージングが可能。
     
ゼブラフィッシュの脳血管系
冠状方向でイメージングしたゼブラフィッシュの脳血管系。1,000 nmでの2光子レーザー励起で取得。蛍光はGaAsP BiG.2 NDDで取得。深さに応じて色分けをした293 µmのZスタック。試料ご提供:Fish Facility, Leibniz-Institut für Alternsforschung – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Jena, Germany
神経細胞の胞体内をGFP標識したマウス脳切片
神経細胞の胞体内をGFP標識したマウス脳切片。GaAsP BiG.2 NDDを用いて、1,000 nmの2光子レーザー励起で100 µmのボリュームを撮影。データセットを深さ別に色分けし、正射影をZEN blueで作成。試料ご提供:Prof. J. Herms, LMU, Munich, Germany

アプリケーション

ZEISS LSM 980のアプリケーション例

ヒトデの卵母細胞における減数分裂
深さ情報を色分けして52 µmのサブセットを示したもの。この動画では、減数分裂中のヒトデの卵母細胞で、Histone 1-Alexa 568で標識した染色体の輸送を表示。Airyscan CO-8Yモードで、2.4秒ごとに67 µmのZスタックを取得。染色体の輸送と同時に、核小体(大きな球体構造)が分解。

ヒトデの卵母細胞における減数分裂
3Dレンダリングは、Z軸(最大輝度)と時間(カラーコード)でプロジェクション、核内の染色体の動きを表示。© ご提供:P. Lenart, MPI for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany

卵母細胞とは、初期の胚発生に必要なすべての栄養が蓄えられた、大きな核を持つ非常に巨大な細胞です。卵母細胞は受精の前に分裂します。そして、この非常に大きな細胞がどのように細胞分裂するかが、P. Lenart研究室の研究テーマです。
驚くことに、卵母細胞の核内に分散した染色体を集めるために、アクチンのネットワークが必要であることがわかりました。その後、染色体は微小管に渡され、微小管が染色体と結合し、紡錘体上に並べられます。アクチン駆動輸送期と微小管駆動輸送期の速度は非常に異なるため、染色体の動きを追跡することで分化特性を識別できます。

これはイメージングの素晴らしい挑戦です。染色体は80 µmの直径の球形核内に分散しており、約15分かけて輸送されます。2005年には45秒ごとにスタックをすることに成功し、アクチン駆動期と微小管駆動期を識別できました。ここに示した新しい、高解像度のイメージングが輸送メカニズムの詳細についてさらに解明できるようになることを期待しています。

Peter Lenart氏

マウス脳の脳室系の上衣組織外植片

このZEN Connectプロジェクトでは、マウス脳の脳室系の上衣組織外植片を用いて実施された実験を記録しています。実験セッションのすべての取得データの相関情報が保持され、 カメラとLSMのオーバービュー画像から、取得した繊毛運動の試料内の位置を正確に記録できます。上衣壁に沿って繊毛が生成した流れのフローマップをリファレンスとして追加しています。

マウス脳の上衣組織外植片上の蛍光標識された運動性繊毛のオーバービュー

マウス脳の上衣組織外植片上の蛍光標識された運動性繊毛のイメージングに際し、Airyscan 2マルチプレックスCO-8Yモードで高速タイリングしてオーバービューを取得し、関心領域を見つけています。Zスタックの深さ情報は色分けして表示。取得した運動性繊毛の正確な位置が示されています。

脳上衣の蛍光標識された運動性繊毛の、143フレーム/秒のライブイメージングです。画質とスピードを兼ね備えたAiryscan CO-8Yモードで取得しています。繊毛運動の方向と周波数の詳細な解析ができます。© ご提供:G. Eichele, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany


© ご提供:M. Paoli, Galizia Lab, University of Konstanz, Germany

ゴキブリの脳、胸部、および腹部の神経節は、腹側神経索を形成する上行性および下行性の介在ニューロンの両側性結合束により、互いに結合されています。この標本では、左右の結合束を食道下神経節の後方で個別に標識し(Alexa 488:緑、Alexa 647:マゼンタ)、異なる神経網内、および脳の同側と対側の部分全体に神経支配が及んでいる様子を観察(DNAをDAPIで標識:シアン)しました。タイリングとスティッチングでボリューム全体(3 x 2.3 x 0.26 mm)のイメージングを実行。大容量データセットのレンダリングや解析に最適なarivis Vision 4Dを用いて、全体像の3Dアニメーションを作成しました。arivis Vision 4Dの4D viewerは、個別のチャンネルの特長を強調するために、独立して可視化条件の調整が可能です。

これらの設定は、クリッピングプレーンや個々のチャンネルの不透明度の変化とともに、キーフレームに保存され、ソフトウェアが自動的に補間してシームレスなアニメーションを作成することができます。アニメーションは高解像度のビデオレンダリングの前にプレビューや編集が可能です。


ゼブラフィッシュは、血管の発達を研究するためのモデルとして確立されています。多光子イメージングは、ゼブラフィッシュの脳の複雑な血管パターンを深く捉えるのに最適な方法です。さらに、第二高調波(SHG)により、追加標識を必要とせずに、周囲の組織の構造情報を取得できます。


矢状方向のゼブラフィッシュの脳と眼の血管系(緑)とSHG(グレー)。1,000 nmの2光子レーザーで267 µmのボリュームを取得、GaAsP BIG.2検出器で検出。SHGで網膜細胞や眼筋などの組織構造を可視化。試料ご提供:Fish Facility, Leibniz-Institut für Alternsforschung – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Jena, Germany


近赤外(NIR):標識数を増やす
複雑な生物学の世界を表現するには、標識数を増やすことが大きなメリットになります。LSM 980は、900 nmまでの広い蛍光領域を網羅し、複数の標識を同時にイメージングすることができます。Cos-7細胞は4種類の蛍光色素で標識されており、そのうち2種類は近赤外領域(NIR)に蛍光ピークを持つAlexa 700とAlexa 750でした。フレキシブルなLSM 980 QuasarとNIR検出器を用いて、すべての標識を最適な感度でイメージングしました。

Anti-TOM20 AF750(赤)、Anti-Tubulin AF700(シアン)、アクチン Phalloidin-OG488(マゼンタ)、DAPI(黄)で標識したCos-7細胞。ZEISS NIR検出器を含むLSM 980のチャンネルモードでイメージング。蛍光シグナルはLinear Unmixingによって分離され、スペクトル的に重なり合う色素Alexa 700とAlexa 750を明確に分離することができました。

Cos-7細胞 Anti-TOM20 AF750(赤)、Anti-Tubulin AF568(シアン)、アクチン Phalloidin-OG488(マゼンタ)、DAPI(黄)。
試料ご提供:Urs Ziegler and Jana Doehner, University of Zurich, ZMB, Switzerland
Cos-7細胞 Anti-TOM20 AF750(赤)、Anti-Tubulin AF568(シアン)、アクチン Phalloidin-OG488(マゼンタ)、DAPI(黄)。

簡単な操作で相関関係を構築
顕微鏡の世界が徐々に大きな試料に移行していくにつれ、位置関係を維持し、イメージングした領域を記録しておくことが重要になります。AI Sample Finderは、T-PMT検出器またはカメラを使って、試料キャリアの分類、試料の識別、フォーカスの検出、および高速なオーバービュー画像の作成を自動的に行います。位置確認用のオーバービュー画像を使って自由にナビゲートし、目的の構造に楽に移動して、 自分の研究に必要な情報がある領域だけをイメージングできます。ZEN Connectは、試料に関するすべてのデータの関連付けをします。

この例では、マウスの腸管組織を、500~850 nmの発光スペクトルを持つ3種類の蛍光色素で標識しています。AI Sample Finderがキャリアを自動的に識別し、T-PMTを使ってAlexa 488標識を撮影し、オーバービュー画像を作成しました。このオーバービュー画像は、試料のナビゲーションや関心領域の識別に利用します。ZEISS LSM 980 QuasarとNIR検出器で目視できる標識と、目視できない標識の画像を最適な感度で取得しました。

マウスの腸の組織切片
マウス腸管組織断面を染色し、腸管神経系のシナプス前の接点を示すSubstance P(シアン、Alexa488)、腸管神経細胞を示すHuC/D(黄、Alexa568)、腸管神経細胞のサブポピュレーションを示すneuronal Nitric Oxide Synthase(nNOS、赤、Alexa750)を表示したもの。試料ご提供:Pieter Vanden Berghe, LENS & CIC, University of Leuven, Belgium

このマウス小脳の例のように、多光子顕微鏡と3Dタイリングおよびスティッチングを組み合わせることで、大きな試料をイメージングできます。超解像モードでのAiryscan 2イメージングにより、特定の関心領域の超解像画像を取得でき、2光子イメージングとシームレスに組み合わせることができます。ZEN Connectは、異なる実験から得られたすべての情報をまとめ、高解像度の画像をより大きな構造にマッピングし、コンテキストを捉え、ファイル整理を簡素化します。

抗カルビンジン(Alexa-568)および抗GFAP(Alexa-488)で標識されたマウス小脳。
抗カルビンジン(Alexa-568)および抗GFAP(Alexa-488)で標識されたマウス小脳。

抗カルビンジン(Alexa-568)および抗GFAP(Alexa-488)で標識されたマウス小脳。両方の蛍光色素を780 nmの2光子レーザーで励起し、蛍光シグナルはBIG.2検出器で同時に収集しました。3Dタイリングとスティッチングで構造全体をカバーし、ZEN blueで正射影を作成。プルキンエ細胞の高解像度画像を取得するために、特定の関心領域をAiryscan 2検出器でイメージング。Airyscan 2のデータセットを処理した後、ZEN blueで正射影を作成。個々の超解像画像を、ZEN Connectで小脳の画像上にアライメントしました。試料ご提供:L. Cortes, University of Coimbra, Portugal

ダウンロード

ZEISS LSM 980 with Airyscan 2

高速マルチプレックスモードによる次世代共焦点顕微鏡

ページs: 43
ファイルサイズ: 5722 kB

The Basic Principle of Airyscanning

ページs: 22
ファイルサイズ: 1472 kB

ZEISS LSM 9 Family with Airyscan 2

Multiplex Mode for Fast and Gentle ConfocalSuperresolution in Large Volumes

ページs: 11
ファイルサイズ: 3114 kB

Beam Path of ZEISS LSM 980

Poster

ページs: 1
ファイルサイズ: 2074 kB

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