ZEISS Correlative Cryo Workflow

酵母細胞の内部で、紡錘体極小体の位置を特定するのは困難です。それらは小さく、存在することがまれな構造です。ZEISS Correlative Cryo Workflowでは、生理的環境に近い状態で細胞構造を正確に識別およびイメージングできます。Airyscan検出器を搭載したLSMを用いることで、細胞の微細構造まで鮮明に観察できます。また、ZEN Connectプロジェクトにおいて細胞の低倍率全体像から高分解能像までの観察結果が統合され、細胞構造の位置特定に必要な全てのデータは集束イオンビームSEMで再利用できます。

Crossbeamを使用することで、特定した領域のTEMラメラをクライオ電子トモグラフィー用に作製することができます。また、ボリュームイメージングも可能です。さらに、このワークフローソリューションによって、顕微鏡間すべての観察結果を再結合し、再構築できます。Crossbeam画像またはTEMトモグラムは、LSMデータと組み合わせ、3Dコンテキストでのレンダリングが可能です。

_{NUP（核膜孔複合体）-GFPおよびCNM67-tdTomatoで標識された酵母細胞。
試料・データご提供：M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland}

がん研究において、ミトコンドリア核分裂の観察により、がん細胞の薬剤抵抗性を評価することが可能性となります。従来の化学固定法はしばしばミトコンドリアの蓄積のようなアーチファクトを生じさせますが、これは核分裂イベントだと誤解釈されることがあります。一方、凍結固定法は化学固定法のアーチファクトを防止し、試料を生理的環境下に近い状態で保存します。

この例は、サファイヤディスク上でプランジ凍結された腺がん細胞です。LSMとCrossbeamいずれのデータからも、密集したミトコンドリアネットワークと核分裂の増大が見られます。Airyscanを搭載した LSMによるイメージングの後、ガラス化試料はCrossbeamに搬送されます。その後ZEN Connectを使用して関心領域の位置特定や各顕微鏡のイメージングデータが重ね合わせられ、取得したすべてのデータが統合されました。

まずクライオ蛍光顕微鏡法により、高圧凍結法で固定された線虫（C. elegans）の体内に存在する分裂中期の胚細胞がイメージングされます。次に、選別された個体に凍結置換で重金属染色を施し、樹脂埋込および切片作成を行います。最後に、Crossbeamにより観察位置を決め、高分解能かつ高コントラストでのイメージングが実行できます。このワークフローを使用して、観察対象の分裂中期を効率よく再構成することができました。このアプローチによる思いがけない発見は、隣接する点状の蛍光シグナルがオートファゴソームらしいと推定できたことです。

以上のように、高圧凍結された厚い試料のクライオ蛍光イメージングによって、過渡的な細胞構造を、生理的環境下に近い状態で捉えて画像化できます。さらに適切な試料処理と相関EMボリュームイメージングを施すことで、当該標的構造の高分解能3次元再構成を達成することができます。

_{データご提供：Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH and Frederick National Laboratory for Cancer Research, USA}