ZEISS Lattice Lightsheet 7

生体細胞の長時間ボリュームイメージング

ZEISS Lattice Lightsheet 7を使用すると、細胞レベル以下の分解能での生体細胞イメージングにライトシート蛍光顕微鏡を利用できるようになります。また、通常使用している試料キャリアもそのままお使いいただけます。使いやすく自動化されたシステムが細胞を光毒性から最大限保護しつつ、数時間~数日に及ぶ細胞内構造と動態のボリュームイメージングを可能にします。これにより、未だかつてないほど細部まで生体の動態を簡単に観察できるようになります。

ZEISS Lattice Lightsheet 7

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Latticeライトシートの原理と、細胞内動態の3Dイメージングにもたらすメリット、およびこの技術の開発プロセスをご確認いただけます。また、ZEISS Lattice Lightsheet 7の機能、お客様の声とアプリケーションについてご紹介しています。

 

生体の細胞内動態を調査する

 
  • 優れた使いやすさ
    通常使用している試料キャリアで直接生体試料を観察可能
  • 光毒性を極限まで抑える
    数時間~数日に及ぶ生体の細胞内動態の観察
  • ほぼ等方性の分解能
    実際の比率で3Dの細部を解明
  • 高速ボリュームイメージング
    カバーガラス上で起こっている興味深いイベントを見逃さない
  • 自動位置合わせシステム
    実験に全意識を集中

Lattice Light Sheetの技術をすべての方に

 

細胞内プロセスの研究において、低ダメージかつ高分解能のライトシートイメージングは非常に重要です。Lattice Lightsheet 7では、この高度な技術のメリットを驚くほど簡単に活用できます。通常の試料調製法を変えることなく、共焦点顕微鏡で以前から使用している試料キャリアで生体試料を観察可能です。また、複雑な位置合わせプロセスはシステム内で自動で行われるため、ユーザーは実験に集中できます。

 
 

光毒性とフォトブリーチを極限まで抑える

 

細胞レベル以下の分解能で生体動態を観察し、微小構造の経時的変化を研究したいというケースはありませんか?しかしながら、従来のイメージングシステムは侵襲性が高く観察対象を破壊してしまうため、すぐ限界に達してしまいます。一方、ZEISS Lattice Lightsheet 7では格子構造の光が感受性の高い試料に自動的に適合し、フォトブリーチと光毒性を大幅に低減させるため、数時間でも数日間でも実験を続けることができます。また、制御された培養環境と内蔵の自動浸液供給システムにより、長時間無人で実験が可能です。

動画:有糸分裂中のLLC-PK1細胞。細胞はH2B-mCherry(シアン)とα-チューブリンmEGFP(マゼンタ)を発現。25時間かけて録画。

高速ボリュームイメージング

 

ZEISS Lattice Lightsheet 7は超高速で画像を取得するため、1秒間に最大3つのボリュームスキャンを実行できます。高時間分解能で試料全体を動的にイメージングできることから、カバーガラス上で起こっている興味深いイベントを見逃すこともありません。X、YおよびZ軸に沿ったほぼ等方性の分解能で試料の3D画像を撮影し、実際の比率で細胞構造の細部をはっきり確認できます。さらに高速レーザー切替えによって色のクロストークを最小限に抑え、最大3色をほぼ同時に使用してイメージングを実行します。

動画:カルネキシン-mEmeraldとEB3-tdTomatoを過渡的にトランスフェクトしたCos 7細胞。EB3は微小管の成長末端をラベルし、微小管動態の制御に欠かせません。カルネキシンは、タンパク質が合成される場である小胞体のタンパク質です。細胞は80秒毎に1ボリュームで1.5時間撮影。撮影ボリューム:175×120×70 μm³。

 

バックグラウンドテクノロジー

Lattice Light Sheet顕微鏡の原理

ライトシート顕微鏡(別名:ガウシアンライトシート顕微鏡)は、一般的に低ダメージな高速イメージング技法として知られています。励起と検出の光路を分離させるという革新的なコンセプトによって、検出用対物レンズの焦点面にある部分の試料のみの照射が可能です。各試料ごとにシートを動かし、焦点面ごとに画像を1つ記録することで、焦点面以外の試料領域を照射せずにボリュームデータを取得可能です。

ライトシート顕微鏡の原理
従来型(ガウシアン)ライトシート顕微鏡は、蛍光の励起と検出を2つの独立した光路に分割し、焦点面からの蛍光のみを励起することで、光学セクションを生成します。

Latticeライトシート顕微鏡には、ライトシート顕微鏡の利点と、共焦点レベルのほぼ等方性の分解能という利点が組み合わされています。Lattice Light Sheet顕微鏡の高度ビーム形成技術によって作成される格子(Lattice)状のライトシートは、標準的なガウシアンライトシートよりもはるかに薄く、イメージング速度を維持しつつ高い分解能が得られます。ライトシートの格子構造は、空間光変調器(SLM)により作成され、格子構造をディザリング処理してなめらかなライトシートを作成し、スキャナーを通して試料に照射します。

Lattice Light Sheet顕微鏡の原理
Lattice Light Sheet顕微鏡は、長くて薄いシート光を形成して細胞レベル以下の分解能を達成することで、ガウシアンビーム(光学セクショニングおよび視野の制限)とベッセルビーム(強いリング、焦点面以外の蛍光の励起)の限界を打破します。

ZEISSによるLattice Light Sheet顕微鏡の導入

Lattice Lightsheet 7の開発にあたりZEISSがこだわったのは、取扱いが簡単であることと、従来の試料調製法を適用できることです。また、高分解能顕微鏡用の標準の試料キャリアを使用するには倒立型顕微鏡の構成が最も重要な前提条件となります。蛍光は試料から放出され、水性の細胞培地、傾斜したガラス製カバースリップおよび水浸部分を通過してから検出用対物レンズに入射するため、倒立型顕微鏡の構成では、屈折率のミスマッチという課題が主に生じます。

優れたZEISS光学系

そこで、ZEISS独自の光学素子を検出ビームパス上に配置することでこの屈折率のミスマッチを相殺し、共焦点顕微鏡と同等の簡便さと迅速性を備えた試料イメージングを実現しました。

ZEISS Lattice Lightsheet 7の光学系
試料キャリアと中核になる光学系モジュールの図解:励起用対物レンズ(1)、メニスカスレンズ(2)、自由曲面光学系を有した検出用対物レンズ(3)。(A)は、屈折率変化の補正なしの画像例、(B)は、屈折率変化の補正ありの画像例。

製品の特長

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 培養チャンバー
標準35 mmディッシュを装填した培養チャンバー。

標準の試料キャリアの使用

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 培養チャンバー
標準35 mmディッシュを装填した培養チャンバー。

通常の試料調製法を変えることなく、共焦点顕微鏡で以前から使用している試料キャリアで生体試料を観察できます。ZEISS Lattice Lightsheet 7は、底部にNo. 1.5のカバースリップを用いる標準試料キャリアで使用可能です。

  • スライド
  • 35 mmディッシュ
  • チャンバースライド
  • マルチウェルプレート
ZEISS Lattice Lightsheet 7 - LED照明
低ダメージの透過照明により、試料の位置を素早く特定します。

迅速かつ低ダメージで試料の位置特定

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - LED照明
低ダメージの透過照明により、試料の位置を素早く特定します。

内蔵の透過LEDと斜方検出がDICのようなコントラストを生成することで、簡単に試料の位置特定ができ、 必要に応じて、透過LEDを白色からより低ダメージな照射の赤色に変えられます。さらに、長時間に及ぶ観察中に、透過光光源を組み込むことも可能です。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 5軸ステージ
5軸ステージでは高精度・高速と長い駆動距離が組み合わされ、マルチウェルプレートのイメージングに適しています。

自動の試料レベリング

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 5軸ステージ
5軸ステージでは高精度・高速と長い駆動距離が組み合わされ、マルチウェルプレートのイメージングに適しています。

このシステムの特別設計である独自の5軸ステージは、X、Y、Z軸方向に移動できる上、高い精度でX軸とY軸への傾斜も可能で、キャリア寸法や試料位置のごくわずかな偏差も補正します。試料のレベリングは自動で行われ、時間のかかる手作業から解放されます。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - ビームパス
ZEISS Lattice Lightsheet 7のビームパスの図解(クリックして拡大)。

すべての光学素子の自動位置合わせ

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - ビームパス
ZEISS Lattice Lightsheet 7のビームパスの図解(クリックして拡大)。

最高の画像を取得するには、Latticeライトシートを試料ごとに最適化しなければなりません。そのためZEISSはすべての光学素子の位置を自動で合わせることにより、時間を要する手動調整を不要にしました。革新的な励起ビームパス設計によって、SLMの設定を変更することなく、迅速にレーザーラインを変えられます。その結果、ほぼ同時にマルチチャネルデータセットを取得できるため、試料に発生するどんなイベントも見逃しません。

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 自動浸液供給
ZEISS Lattice Lightsheet 7 自動浸液供給装置。

長時間の無人実験

ZEISS Lattice Lightsheet 7 - 自動浸液供給
ZEISS Lattice Lightsheet 7 自動浸液供給装置。

培養

変化する環境条件下でも、内蔵の培養システムによって安定した培養を長時間維持することが可能です。また顕微鏡は、温度、二酸化炭素 および酸素 濃度、ならびに湿度を自動で制御・モニタリングし、実験中の試料の恒常性を維持します。蓋にはガラス窓が付いているため、実験中いつでも簡単に素早く試料をチェックできます。

自動浸液供給

準備として、システムのエア抜きをしてください。そのあとは、実験の要件に合わせて浸液が自動的に供給されます。浸液はソフトウェアが自動的に補給するため、画像取得が妨げられる心配はありません。また、菌が繁殖しないように、浸液供給容器に照明が当たらないようになっています。なお対物レンズは浸液から保護されており、浸液が過剰に供給されても濡れることはありません。


典型的なアプリケーション例

典型的なアプリケーション例 典型的な試料 タスク

生細胞イメージング

  • 接着細胞
  • 浮遊細胞
  • 細胞内プロセスの高速ボリュームイメージング:オルガネラの形態および動態、オルガネラ間の相互作用、小胞輸送
  • 膜動態のボリュームイメージング
  • T細胞の移動性や活性化など免疫細胞のボリュームイメージング
  • 光毒性とフォトブリーチを最小限に抑えた、数時間~数日間にわたる生細胞の低ダメージイメージング
  • 細胞増殖とアポトーシスアッセイ

3D細胞培養

  • スフェロイド
  • オルガノイド
  • 嚢胞
  • ハイドロゲル封入細胞
  • 直径200 µm以下のスフェロイドまたはオルガノイドのライブイメージング
  • オルガノイドの自己組織化
  • オルガノイド内部の細胞遊走および増殖
  • 細胞間相互作用、3D構成、遊走および形態のイメージング
  • ニューロン活動のin vitroイメージング

モデル小型生物

  • ゼブラフィッシュ胚
  • C. elegans胚
  • ショウジョウバエ胚
  • ほぼ等方性の分解能で構造の細部を3D分解
  • 胚および直径100 µm以下の小型生物の細胞と細胞内動態を高速イメージング
  • 細胞遊走、細胞間相互作用、細胞周期、小胞輸送

卵母細胞

  • 卵母細胞全体の細胞内の細部を3Dでライブイメージング

拡大試料

  • 水性ゲルで拡大した小型試料

ZEISS Lattice Lightsheet 7のアプリケーション例

ラミンB1の活動

 

ラミンB1は核膜に存在し、有糸分裂中、核膜の分解と再形成に関与します。これまで、有糸分裂中の細胞周期の様々な段階において、いわゆる「核膜陥入」が各種の細胞で形成されることがたびたび報告されてきました。核膜陥入は、核膜に始まり核を横断する管状構造で顕著となることがあります。この独特な構造はたびたび報告されてきましたが、これまでのほとんどの研究は固定細胞を使用したものでした。そのため、この構造の機能は、多数の仮説が立てられてはいるものの、まだ多くが明らかにされていません。

このデータセットは、Allen Institute for Cell Science(シアトル)からご提供いただいた細胞株「mEGFP-標識ラミンB1を内因的に発現するヒト誘導多能性幹細胞(AICS-0013)」を記録したものです。1.5分毎に1ボリュームでイメージングし、約8時間記録しました。全期間を通して、有糸分裂中の細胞が観察されています。ほとんどの細胞において、全細胞周期にわたり核膜陥入の形成と動態がはっきりと観察できます。

有糸分裂プロセスは極めて繊細で光感受性が高いため、そのイメージングには低ダメージ照明が不可欠です。細胞は損傷したDNAを複製しないように、励起光から損傷を受けると有糸分裂を即座に停止します。長時間にわたる有糸分裂中のイメージングには、Lattice Lightsheet 7の低ダメージイメージングと、非常に安定したシステムが必要です。高速ボリュームイメージングとほぼ等方性の分解能の組み合わせにより、試料を全角度から観察し、独自の細胞内構造を詳しく観察できます。ZEISS Lattice Lightsheet 7は、こうした困難な実験に最適なツールです。これまで実現不可能だったアプリケーションが可能になり、実際の研究において優れた操作性を実感いただけます。

最高ボリューム速度での細胞内動態

 

カルネキシン-mEmeraldとEB3-tdTomatoを過渡的にトランスフェクトしたCos 7細胞。EB3は微小管の成長末端をラベルし、微小管動態の制御に欠かせません。カルネキシンは、タンパク質が合成される場である小胞体のタンパク質です。細胞は80秒毎に1ボリュームで1.5時間撮影。撮影ボリューム:175×120×70 μm³。

 

アクチン-GFP(細胞骨格、シアン)を安定的に発現するU2OS細胞の動態を示すタイムラプス動画。さらに細胞は、MitoTracker™ Red CMXRos(ミトコンドリア、緑)とDraq 5(核、マゼンタ)でもラベル。

 

Tomm20-mEmeraldとカルレティキュリン-tdTomatoを過渡的にトランスフェクトしたCos 7細胞。Tomm20はミトコンドリア外膜をラベルし、カルレティキュリンは、タンパク質が合成される場である小胞体のタンパク質です。どちらも極めて繊細で光感受性が高く、従来の技法では画像の取得が困難なオルガネラです。30秒毎に1ボリューム、撮影時間1時間15分、撮影ボリューム:175×210×20 μm3。合計85,800枚の画像を記録。150時点で体積面572。

 

Lifeact-GFPを発現したCos 7細胞。最大輝度投影法。細胞は10秒毎に1ボリューム(115×60×25 μm³)で9時間連続で撮影。合計1,005,000枚の画像を記録。5,000時点で体積面201。

 
 

mEmerald-Rab5aとGolgi7-tdTomatoを過渡的にトランスフェクトしたCos 7細胞。Golgi7 はゴルジおよびゴルジ小胞に関連するタンパク質で、 Rab5aは初期エンドソームマーカーです。ほぼ等方性の分解能による小胞の3D追跡を実現します。追跡はarivis Vision4D®で実施。

 

Lifeact-GFPを発現したT細胞。色分けした深さ投影と最大輝度投影法を並べたもの。T細胞は2.5秒毎に1ボリュームで1時間超連続で撮影。試料ご提供:M. Fritzsche, University of Oxford, UK

初期発生 | 卵母細胞

 

核膜(抗ラミン、シアン)、アクチン(ファロイジン、マゼンタ)、微小管(抗チューブリン、黄)を染色したマウスの固定卵核胞期卵母細胞。微小管とアクチン構造の高分解能イメージングには、Sinc3 15×650 Latticeライトシートを使用しました。微小管の3D構造を動画でご覧頂けます。試料ご提供:C. So, MPI Göttingen, Germany

 

核膜(抗ラミン、シアン)、アクチン(ファロイジン、マゼンタ)、微小管(抗チューブリン、黄)を染色したマウスの固定卵核胞期卵母細胞。卵母細胞全体のイメージングには、Sinc3 100×1,800 Latticeライトシートを使用しました。試料ご提供:C. So, MPI Göttingen, Germany

 

第II分裂中期で停止させ、ミトコンドリア(シアン)、微小管(マゼンタ)、染色体(黄)を染色したマウスの生きた卵母細胞。試料ご提供:C. So, MPI Göttingen, Germany

モデル小型生物の発生 | ゼブラフィッシュ

 

DeltaD-YFPトランスジェニックゼブラフィッシュ胚(Liao et al. 2016, Nature Communications)。内因性調節領域を含む導入遺伝子により誘導される融合タンパク質で、尾芽と未分節中胚葉に発現。細胞皮質と、輸送小胞(緑)に対応する点にシグナルを確認できます。核はマゼンタで表示。胚は8秒毎に1ボリューム(150×50×90 μm3)で5分間連続で撮影。試料ご提供:Prof. Andrew Oates, EPFL, Switzerland

 

ゼブラフィッシュ胚の高速動画。輸送mRNA分子(緑)のボリュームイメージング。核はマゼンタで表示。データは最大輝度投影法で表示。2.5秒毎に1ボリューム(86×80×12 μm3)で記録。試料ご提供:Prof. Andrew Oates, EPFL, Switzerland

 

輸送mRNA分子をarivis Vision4D®で追跡。核の参照トラックを使用してゼブラフィッシュ胚の運動を補正し、 次にmRNA分子を個別に経時的に追跡し、速度や方向性などの統計データを取得。試料ご提供:Prof. Andrew Oates, EPFL, Switzerland

モデル小型生物の発生 | C. elegans胚

 

核を染色したC. elegans胚。この動画は、胚を色分け表示した深さ投影を示しています。胚は700ミリ秒毎に1ボリュームで10分間以上連続で撮影。撮影ボリューム:115×50×30 μm³。合計101,000枚の画像を記録。1000時点で体積面101。お客様よりご提供いただいた試料

 

核を染色したC. elegans胚。この動画は、胚を色分け表示した深さ投影を示しています。胚は5秒毎に1ボリュームで19時間以上連続で撮影。標準的な睡眠覚醒周期を辿っているのが観察できます。撮影ボリューム:115×50×30 μm³。合計23,836枚の画像を記録。236時点で体積面101。お客様よりご提供いただいた試料

 

後期豆期(受精後約400分)のC. elegans胚。約560の核をHIS-58::mCherry(マゼンタ)で、中心小体をGFP::SAS-7(緑)で染色。有糸分裂中の細胞が、紡錘体極にHIS-58::mCherryと中心小体の凝縮シグナルを示しています。試料ご提供:N. Kalbfuss, Göncy Lab, EPFL, Switzerland

モデル小型生物の発生 | ショウジョウバエ胚

 
 

キイロショウジョウバエは、生物医学など多くの研究分野においてモデル生物とされています。遺伝子組み換えされた多数の変異体が、研究用として提供されています。この動画には、GFPラベルされたショウジョウバエ胚の経時的な動きが示されています。合計91,100枚の画像を記録。100時点で体積面911。15秒毎に1ボリューム、撮影時間25分、撮影ボリューム:300×455×145 μm3

3D細胞モデルの形成

 

スフェロイドとオルガノイドは器官のin vitroモデルです。はるかに小さく単純であるにもかかわらず、作製しやすいため、発生生物学者にとって器官形成を研究するための貴重なツールとされています。細胞の単層のみで構成されることが多い細胞培養とは異なり、3D構造のスフェロイド/オルガノイドの細胞は、3D細胞モデル内部での細胞遊走や細胞分化を調査できます。Lattice Lightsheet顕微鏡ではオルガノイドの成長と自己組織化の撮影ができます。H2B-mCherry(シアン)とα-チューブリン-mEGFP(マゼンタ)発現細胞を含むスフェロイドの3Dレンダリング画像をこちらで見ることができます。ラベルされていない細胞もあります。

成長中の植物および植物の種子 | 花粉粒と花粉管

 

花粉管内部におけるミトコンドリアの動態を観察してみましょう。ミトコンドリアは端部の先端に向かって移動し、管の中央部に戻っています。ミトコンドリアは輸送中に、修復プロセスのために、および生物分子の共有と分配のために、融合と分裂を繰り返します。ご提供:R. Whan, UNSW, Sydney, Australia

 

ミトコンドリア(MitoTracker Green、緑)およびリソソーム(Lysotracker Red、赤)を染色した花粉管。花粉管が花粉粒の亀裂から伸びているのを観察してみましょう(自家蛍光によって可視化)。ミトコンドリアは花粉管の最先端に向かって伸び続けることはせず、先端から数ミクロン手前で停止しています。データセットのレンダリングはarivis Vision4D®で実施。ご提供:R. Whan, UNSW, Sydney, Australia

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生体細胞の長時間ボリュームイメージング

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