ZEISS Lightsheet 7

生体サンプルと透明化サンプルのマルチビューイメージングのためのライトシート顕微鏡

 

ライフサイエンス分野での研究においては、イメージングに高度な技術が求められることがあります。生体モデル生物の全体像、組織、および細胞などが成長する様子をイメージングしなければならないことがしばしばあります。独自の照明原理に基づいて設計されたライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、このような試料のイメージングを高速かつ低ダメージで行うには最適です。並外れた安定性が特徴のLightsheet 7は、長期間にわたる(数日間におよぶような場合でも)生体試料の観察をかつてないほど低い光毒性で、行うことができます。さらに、このライトシート顕微鏡を使うことで、透明化処理した非常に大きなサンプルを全体像および細胞レベル以下の分解能で撮影することができます。
Lightsheet 7専用の光学系、サンプルチャンバー、およびサンプルホルダーなどで拡張し、選択した透明化方法の屈折率に合わせて正確に調整すれば、マウスの全脳などの大きなサンプルでもイメージングできます。ZEISSのこの実証済みで安定したボックス型ライトシート顕微鏡には、これらの柔軟性に富んだ機能がすべて備えられています。

Highlights

  • 透明化したサンプルのイメージング

どの透明化方法を用いるかは、撮像対象の組織、使用する蛍光標識、サンプル自体のサイズなどによって異なります。Lightsheet 7は、これらの異なる条件すべてに適合するように設計されています。1.33から1.58までの屈折率の、ほぼすべての透明化溶液で、最大2cmの試料をイメージングできるようになりました。
この安定性に富んだライトシート顕微鏡は、組み立てた状態で納品致しますので、すぐにお使いいただくことができます。これを用いて全体像や、細胞レベル以下の分解能のデータの取得ができます。

Lightsheet 7は、透明化処理されたオルガノイド、スフェロイド、器官、脳、またはその他のサンプルのイメージングを、高速で低ダメージで行うための最適な顕微鏡です。

 

C57 BL6J mouse perfused with PBS, CellTracker™ CM-DiI Dye, and 4% PFA. Cleared using iDISCO+ protocol, final RIMS is Ethyl Cinnamate.

Sample Courtesy of:
Erin Diel – Harvard University; Harvard Center for Biological Imaging Room 2052, 16 Divinity Ave, Cambridge, MA 02138, USA

  • 最高の画質と安定性

ZEISS Lightsheet 7 は大変使いやすく、LSFMイメージングをより広いアプリケーションで利用でき、しかも最高な画質でのイメージングが可能です。新しく設計された光学系とサンプルチャンバーを使えば、屈折率を完璧に合わせることができます。また、新しいサンプルホルダーにより、より大きいサイズのサンプルの設置も容易に行うことができます。

スマートなソフトウェアツールが備えられており、データ処理パラメータと同様に、ライトシートとサンプルの位置調整、ズーム設定、タイルおよび多点などの撮像パラメータの設定がしやすくなっています。これらの新しい機能はすべて、シリンドリカルレンズとライトシート照明を生成するためのレーザースキャニング機構のZEISSの信頼性の高い組み合わせで一体化されています。

特許を取得しているPivot Scanテクノロジーを使えば、最高な画質でアーチファクトのない光学切片像を得ることができます。

Dedicated optics for your ZEISS Lightsheet 7
  • 真実の姿を観察 – 高速かつ高感度で

Lightsheet 7には現在、量子効率の高いpco.edge sCMOSディテクターが装備され、低い励起光量での高速観察が可能になっています。励起光によるサンプルへの悪影響を抑え、サンプルの真実の姿を観察することができます。垂直方向の試料の撮像を最速のフレームレートで行うためには、CMOSディテクターAxiocam 702がご選択いただけます。専用のサンプルチャンバーにより、加温、冷却、CO2のコントロールを行い、実験に最適な環境を整えます。

マルチビュー機能および外付けデバイスを制御するためのトリガーオプションを付け加えれば、Lightsheet 7は、ほとんど無限とも言える広範な生物に対応し、そこで起こる生体現象を観察することのできる、理想的なライトシート顕微鏡となります。

Development of Arabidopsis.
Arabidopis Flower Development – Sample: Courtesy of S. Valuchova, P. Mikulkova and K. Riha, Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk University, Brno, Czech Republic.

ライトシート蛍光顕微鏡の原理

ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)では、蛍光の励起と検出とが2つの異なった光路に分割されており、照明軸は検出軸に対して垂直の位置関係にあります。これは、焦点面の蛍光のみを励起することによって固有の光学切片を生成し、一度にサンプルの薄い切片を照明することができるということを意味します。

ピンホールや画像処理は必要ありません。焦点面からの光は、共焦点顕微鏡やその他のレーザー走査型顕微鏡のように画素単位ではなく、カメラの複数の画素上に集められます。カメラベースのディテクター上の画像データの収集並列化によって、他の顕微鏡技術より弱い励起光で画像を迅速に撮影できます。

要約すると、LSFMは光学的なセクショニング効果と焦点面全体からの並列画像取得とを組み合わせたものになります。これによって極めて高速かつ、高い励起効率で3D画像の撮影ができます。

Lightsheet 7 LSFM illumination principle

How Lightsheet 7 works

 

ZEISS Lightsheet 7を用いた試料の位置決めおよび撮影が簡単に行えます。こちらの動画でご確認ください。

特許取得のPivot Scanner

均質な照明

ライトシートが試料を透過するとき、たとえば核などのいくつかの試料構造は、励起光を吸収または散乱させます。これによって、左側の画像のように、照明軸に沿って影ができます。この現象はあらゆる蛍光顕微鏡で起こるものですが、ライトシート蛍光顕微鏡の照明軸は観察軸に対して垂直の位置関係にあるため、この現象はさらに明確に視認されます。

Lightsheet 7では特許取得のPivot Scannerが撮像中、ライトシートの角度を上下方向に変更します。照明角度を変更することで、影のできる方向がまちまちになり、右側の画像のように、励起光はこの不透明な構造の背後にある領域にも到達します。
この特許取得のPivot Scannerは、アーチファクトのない画像を取得するための完璧な方法であり、撮影後に行う画像処理や画像解析ステップの改善につながります。アーチファクトの問題を解決するには、その発生の大元に取り組むことが常により良い選択であると言えます。

ZEISS Lightsheet 7 at Work

腎臓病学

マウスの腎臓をiDISCOプロトコルで透明化し、桂皮酸エチルで撮像した。ZEISS Lightsheet 7、検出用光学系 5x/ 0.16 foc および Clr 20x/ 1.0 nd = 1.53(挿入画像)を使用。
赤:マウスに、DyLight 594複合トマトレクチンで灌流、血管系および糸球体を視覚化。緑:組織の解剖学的構造を視覚化する自家蛍光。

3Dの臓器全体のイメージングと画像解析で糸球体のサイズおよび数を調べることで、たとえば糖尿病性腎症などのさまざまな腎臓疾患のメカニズムを理解するのに役立ちます。ACQUIFER HIVE上のarivis Vision4D® を用いて処理しています。

 

Sample courtesy of U. Roostalu, Gubra, Denmark.

 

Sample courtesy of U. Roostalu, Gubra, Denmark.

発生生物学

機械感覚神経線維の解剖学的組織を示すP10マウスの気管の3Dデータセット。
染色:DAPI、IV型コラーゲン(Alexa 488抗体)、感覚線維(tdTomatoを発現するレポーター株、Alexa 555抗体)、神経フィラメントタンパク質NF200(有鞘神経線維、Alexa 647抗体)。
サンプルはPEGASOSで透明化(Jing他;2018、Cell Research)、BB-PEG(RI=1.54)で、5x/ 0.16 foc 検出用光学系、およびClr 20x/ 1.0 nd = 1.53を用いて撮像。

倍率5倍のデータセット:
ピクセルサイズ0.61x 0.61x 1.63 μm、3×3 タイル、ズーム 1.5倍、z1230枚、体積 2.57 × 2.58 × 2 mm
倍率20倍のデータセット:
ピクセルサイズ 0.23x 0.23x 0.58μm、1×5 タイル、ズーム 1.0倍、z4206枚、体積 2.0 × 0.45 × 1.82 mm

 
 

Sample courtesy of P.-L. Ruffault, C. Birchmeier, Laboratory of Developmental Biology / Signal Transduction; A. Sporbert, M. Richter Advanced Light Microscopy; M. Delbrück, Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany.

脊椎動物の四肢および脊髄の再生

サンショウウオは、その四肢や脊髄を再生する、驚くべき能力を備えています。分子遺伝学ツールを用いることで、この複雑な再生機能を司る幹細胞と、それらの増殖を開始する損傷応答シグナルを特定することができます。

このメキシコサンショウウオの前腕は、桂皮酸エチルで透明化されており(Masselink、W. et.al., Development 146,(2019))、屈折率1.57の5×/ 0.16 foc検出用光学系で撮像されました。マルチタイルデータセットは、ACQUIFER HIVEデータプラットフォーム上のZENイメージングソフトウェアとarivis Vision4D®ソフトウェアで位置調整、合成、レンダリング表示されています。

 

Sample courtesy of W. Masselink, Tanaka lab, Research Institute of Molecular Pathology, IMP.
Image courtesy of P. Pasierbek, K. Aumayr, IMP BioOptics, Vienna, Austria.

神経形態学

ニューロンは非常に複雑な形態をしており、臓器全体に広がっているため、人間の脳内の細胞全てを撮像することはほとんど不可能です。オルガノイドは、神経幹細胞培養からのニューロンの生成を含め、人間の脳の再現をある程度まで可能にします。桂皮酸エチル(ECi)透明化法を用いると、神経の形態をローカルレベルからグローバルレベルまで研究することができます。これにより、3Dでの神経形態学研究の可能性が飛躍的に広がります。これはたいへん魅力的なことです。

右の画像は、35日齢の神経オルガノイドを、GFP/tdtomato(GFPが3%、tdtomatoが3%)でまばらに標識し、Clr 20x/ 1.0 nd = 1.53 の対物レンズを使って撮像したものです。

ピクセルサイズ: 222 × 222 × 567 nm.
画像体積: 1.66 × 0.66 × 1.6 mm.

 

Sample courtesy of D. Reumann and J. Knoblich, IMBA, Vienna, Austria.

免疫学

正常なリンパ器官を3Dイメージングすることにより、ウイルス感染に対する免疫応答を分析および定量化することができます。試料を採取する前に野生型の宿主マウスにT細胞を移植しました。ノードは、洗浄、固定、及びCe3D(Li et al., PNAS 163, 2017)を用いて透明化し、5x/ 0.16 検出用光学系を用いて、RI = 1.49(ph 7)で撮像を行いました(体積 2.5 × 2.5 × 1.6 mm)。

この画像では、GFP標識されたネイティブCD8+ T細胞を黄色に、B細胞ろ胞はB220を用いて青色(シアン)に、CD31血管ネットワークをマゼンタに示しています。

Inguinal mouse Lymph node

Sample Courtesy of Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia

マウスの脳全体の血管マッピング

C57 BL6J マウスを PBS および 4%の PFA を使って灌流しました。
Cell-Tracker™ CM-DiI D色素を使って脳を灌流し染色しました。これは、管脈構造膜を標識することのできる脂質色素です。iDISCO+ プロトコルを用いてサンプルを透明化し、最終的に桂皮酸エチル内を屈折率マッチング用に使い平衡化しました。
それから、検出用光学系 Fluar 2.5×/ 0.12 を用いて、Translucense社のメゾスケールサンプルチャンバで、RI = 1.565 の桂皮酸エチルでイメージングしました。

右の高分解能の挿入画像は、Clr Plan-Neofluar 20×/ 1.0 Corr nd = 1.53 を用いて撮像されたものです。
画像体積は、13.1 × 13.1 × 6 mm で、ピクセルサイズは 1.83 × 1.83 × 6.77 μm です。およそ40分かけて、4x4のタイル、zを866枚撮像しました。
データボリュームは93GBです。ACQUIFER HIVEデータプラットフォームで、ZEN撮像ソフトウェアおよびarivis Vision4D®を用いてデータ処理を行いました。

 
 

Sample courtesy of E. Diel, D. Ric hardson, Harvard University, Cambridge, USA.

マウスの脳全体の介在神経細胞およびプルキンエ細胞のマッピング

PV-tdtomatoを発現したマウスの脳は、CLARITY プロトコルを使用して透明化され、最終イメージングは屈折率 RI = 1.46のEasyIndex試薬で行われました。
tdtomatoを発現するパルブアルブミンPV-Creは、脳全体の介在神経細胞および小脳のプルキンエ細胞で発現します。

脳全体のデータセットは、検出用光学系5x/ 0.16 focを用いてZEISS Lightsheet 7で撮像しました。ピクセルサイズは 0.91x 0.91x 5.35 μmで、画像体積は、11x 20x 8.8 mm です(12028 × 22149 × 1621 ボクセル)。6x10タイル、zを1621枚撮像しました。データサイズは1.2TBです(スティッチ後 805 GB)。ACQUIFER HIVEデータプラットフォームで、ZEN撮像ソフトウェアおよびarivis Vision4D®を用いてデータ処理されました。

 

Sample courtesy of E. Diel, D. Ric hardson. Harvard University, Cambridge, USA.

Downloads

ZEISS Lightsheet 7

ライトシート蛍光顕微鏡:生体試料と透明化試料のためのマルチアングルイメージング

ページs: 26
ファイルサイズ: 3924 kB

ZEISS Lightsheet 7

Light sheet fluorescence microscopy for Multiview imaging of living and cleared specimens.

ページs: 26
ファイルサイズ: 8850 kB

ZEISS Lightsheet 7

Light sheet fluorescence microscopy for Multiviewimaging of living and cleared specimens.

ページs: 4
ファイルサイズ: 1871 kB

Technology Note: A Methodology Review

How to Get Better Fluorescence Images with Your Widefield Microscope.

ページs: 11
ファイルサイズ: 1885 kB

Technology Note: ZEISS Lightsheet 7

How to Get Best Images with Various Types of Immersion Media and Clearing Agents

ページs: 10
ファイルサイズ: 2077 kB

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