ZEISS Apotome 3

ワイドフィールド顕微鏡のための蛍光イメージングにおける光学セクショニング

蛍光サンプルの光学断面の作成 - 構造化照明により、フォーカス外の光を簡単かつ効率的に除去できるため、研究に集中することができます。ZEISS Apotome 3は倍率を認識し、適切なグリッドをビームパスに移動します。次に、異なるグリッド位置を持つ複数のイメージから光学断面が計算されます。これは、厚みのある試料であってもフォーカスが合っていない光を除去できる、非常に信頼性の高い方法です。それでも、システムの操作性は相変わらず簡単です。これにより、高分解能でコントラストの高い、優れた光学断面画像を得ることができます。

優れた光学断面：Apotome 3には、異なるジオメトリの3つのグリッドが付属しており、どの倍率を選択しても最高の分解能が得られます。
光源と色素の自由な選択：Apotome 3はお使いの蛍光体と光源に適応します。そのため、実験が複雑になり要件が変化しても柔軟に対応できます。

より多くの構造情報：構造化照明用の特許取得済みアルゴリズムを使用するデコンボリューションにより、作成した画像の質がさらに向上します。これにより、対象のオブジェクトの重要な構造をより正確に認識できます。

特長

優れた光学断面

数百マイクロメートルからナノメートルの範囲のサイズの構造をイメージングするには、通常、倍率の異なる対物レンズを使用します。Apotome 3には、異なるジオメトリの3つのグリッドが付属しており、各対物レンズに最適な分解能を提供します。理想的なグリッドが自動的に選択され、常にコントラストの高い光学断面が得られるため、実験に集中できます。Apotome 3は、従来の蛍光顕微鏡法と比較して、軸方向の分解能を大幅に向上させます。これにより、厚い試料からでも、3Dレンダリングが可能な優れた光学断面を得ることができます。

光源・色素を自由に選択

実験の複雑さや要件は、時とともに変化することがよくあります。そのため、優れた性能だけでなく柔軟性のある機器が必要になります。Apotome 3では、従来のメタルハライドランプ、経済的な白色LED、または穏やかなマルチカラーのColibri照明システムを使用することができます。フィルターを変更するだけで、グリッドを自動的に正しい位置に移動することが可能です。ユーザーの好みに応じて、DAPI、Alexa488、Rhodamin、Cy5、またはGFPやmCherryなどの重要な色素を使用することで、Apotome 3は、ユーザーの蛍光体と光源に適応し、期待通りのシャープで鮮やかな画像を作成します。

ご提供：L. Behrendt, Leibniz-Institute on Aging – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Germany

さらなる構造情報を取得

ご提供：L. Behrendt, Leibniz-Institute on Aging – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Germany

Apotome 3で作成した画像は、構造化照明用の特許取得済みアルゴリズムを使用してデコンボリューションすることで、さらに画質を向上させることができます。システムはすべての生データを保持しながら、ワイドフィールド、光学断面、デコンボリューション画像を切り替えることができるため、柔軟性が最大限に発揮され、最高水準の比較が可能になります。高速で堅牢なデコンボリューションアルゴリズムは使いやすく、画像の横方向と軸方向の両方の分解能を向上させます。コントラストの向上、光学分解能の向上、既存ノイズの抑制により、対象物の構造をより正確に認識することが可能になります。

動作原理

3つのグリッドにより最適光学断面の厚みを確保

焦点面の外側の領域からの放出光が、カメラによって検出されます。試料の厚さまたは体積に応じてコントラストおよび分解能が低下します（図A：従来の落射蛍光照明による取得）。

どの倍率を使用しても、Apotome 3は顕微鏡のビームパスに最適なグリッドを自動的に配置します。不要なバックグラウンド蛍光はグリッド周波数と共に低減され、光学断面は薄くなります。また、焦点面の外側からの画像情報は抑制されます（図B、C、D）。これにより、光学断面のコントラストおよび分解能が向上します。「Lowグリッド」は、この例で最適な断面の厚さを実現しています（図D）。こういった種類の画像は、3D解析やレンダリングソフトウェアでの画像データの処理に特に適しています。

C. elegans、ホールマウント、緑:GFP、青：DAPI、対物レンズ:Plan-Apochromat 20x/0.8 ご提供：Prof. Schnabel, T.U. Braunschweig, Germany

走査メカニズム

Apotome 3は、グリッド構造を試料の焦点面に投影し、走査機構を用いて異なる位置に移動させます。各グリッド位置で、Apotome 3は自動的にデジタル画像を取得します。このシステムは、特許取得済みのアルゴリズムを使用してすべての画像を処理し、コントラストと分解能を向上させた1つの光学断面にします。結果の画像にはグリッド構造がありません。

蛍光励起光はApotome 3スライダー内の2つのガラス板を通過します。グリッド構造が第1のガラス板に適用されると、グリッドパターンが励起光に「刻印」されます。走査機構が第2のガラス板を傾斜させ、グリッドの像が試料の焦点面内で横方向にシフトされます。

グリッド投影の概略図。A：ワイドフィールド画像。B～D：グリッド位置が異なる生画像。E：サンプルを通過した結果の光学断面。構造化された照明により、フォーカス外の光が効率的に取り除かれます（矢印）。

典型的なアプリケーション例

アプリケーション	タスク	ZEISS Apotome 3の機能
細胞培養	2Dイメージング	2D単一画像
	2D画像を手早く画像化	光学断面をモニター上に表示
	強いバックグラウンド蛍光であってもマーカーを正しく検出	自動グリッド選択により各対物レンズとの最適なコントラストを実現
	複数のコントラスト技術の組み合わせ	蛍光チャネル、明視野、DIC、位相差の任意の組み合わせ各蛍光チャネルを光学断面またはワイドフィールド画像として個別に構成
ライブセルイメージング	光毒性の低減	LED照明およびZEISS Axiocamsなどの高感度カメラと組み合わせた場合、特に低い光毒性を達成可能
ライブセルイメージング	タイムラプス画像	最大3枚/秒（露出時間に依存）「バーストモード」によるフレームレートの倍増
ビブラトーム切片、組織標本	3Dイメージング	各対物レンズに対する最適グリッドを自動選択
	光学断面の厚みの変更	試料に合わせて自由に選択可能なグリッド
	侵入度	組織の光学密度に応じて
	3D再構築	統合ソフトウェア機能による画像スタックのレンダリング個々の蛍光チャネルのパラメータを自動転送
	定量的解析	自動システムキャリブレーションによる再現性のあるサイズ測定
ホールマウント	3Dイメージング	マルチチャネル、Zスタックおよびタイムラプス、デコンボリューション、rawデータモード画像、3Dレンダリング
ホールマウント	大きな画像領域	タイル&ポジションを使用した大きな断面の自動取得

ZEISS Apotome 3のアプリケーション例

ショウジョウバエの神経細胞

Molecular and Developmental Genetics, University of Leuven, Belgium

ショウジョウバエの神経細胞、青：DAPI、黄：GFP。対物レンズ：Plan-Apochromat 20x/0.8 ご提供：M. Koch, Molecular and Developmental Genetics, University of Leuven, Belgium

左：従来の蛍光イメージング。右：ZEISS Apotome 3

ショウジョウバエの胚

Institute for Neurobiology,University of Münster, Germany

ショウジョウバエの胚、緑：HRP、赤：グリアマーカー、100µm Zスタック。ご提供：C. Klämbt, Institute for Neurobiology, University of Münster, Germany

マウスの胚

Centre for Anatomy, University of Göttingen, Germany

マウス胚の組織切片、緑：GFP、赤：Cy3。対物レンズ：Plan-Apochromat 40x/ 1.3油浸。ご提供：N. Büttner, T. Vogel, Centre for Anatomy, University of Göttingen, Germany

皮質ニューロン

Leibniz-Institute on Aging – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Germany

DNAと微小管を染色した皮質ニューロンのワイドフィールド画像と3Dレンダリングの比較。ご提供：L. Behrendt, Leibniz-Institute on Aging – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Germany

ワイドフィールド

ZEISS Apotome 3

ワイドフィールド

ZEISS Apotome 3

共生細菌に感染したミヤコグサ（Lotus Japonicus）の根

University of Freiburg, Germany

共生細菌に感染したミヤコグサ（Lotus Japonicus）の根の自家蛍光、mcherryで染色。ご提供：F. A. Ditengou, University of Freiburg, Germany

ワイドフィールド

Apotome 3

Apotome 3＋デコンボルーション

トランスジェニックゼブラフィッシュの幼生

Leibniz-Institute on Aging – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Germany

受精後4日目のトランスジェニックゼブラフィッシュの幼生を染色：グリア線維性酸性タンパク質、アセチル化チューブリン、GFP、DNA。1.2%低融点アガロースに包埋。ご提供：H. Reuter, Leibniz-Institute on Aging – Fritz-Lipmann-Institut e.V. (FLI), Germany