Lattice SIM²搭載ZEISS Elyra 7

かつてない解像度を誇るライブイメージングシステム

従来の顕微鏡の回折限界を超える超解像顕微鏡Elyra 7:Lattice SIM²は、従来のSIM解像度を2倍にし、60 nm以内の間隔でもサブオルガネラ内構造を詳細に識別することができます。生体観察に必要な最小露光時間のみで高速イメージングする場合でも、解像度を犠牲にする必要はありません。特別な試料調製をすることなく、また複雑な顕微鏡技術の専門知識がなくとも、Elyra 7で超解像とハイダイナミックイメージングを組み合わせることができます。

生体のサブオルガネラネットワークを鮮明に観察:
  • 60 nmまでの分解能
  • 最大255 fpsで生細胞のダイナミクスを観察
  • 3つの次元すべてにおいて画像取得を加速
  • 広い視野で非常にシャープな断面像を取得
  • 1つのプラットフォームで様々なイメージング手法を利用可能
Lattice SIM²搭載ZEISS Elyra 7

発表イベント「60 nmの世界」を見逃した方へ

こちらからイベントの動画をご視聴ください。

60 nmまでのサブオルガネラ構造を明らかにし、卓越した解像度で非常に動的なプロセスを観察する様子をご覧ください。焦点面以外の光を抑制することができるので超解像を取得できます。

抗アルファチューブリンAlexa 488で免疫蛍光を介してラベル付けされたCos-7細胞の投影をを色分けして表示。
抗アルファチューブリンAlexa 488で免疫蛍光を介してラベル付けされたCos-7細胞の投影をを色分けして表示。

Lattice SIM²による卓越した解像度

SIMテクノロジーをさらに上のレベルに引き上げる新たな画像再構築アルゴリズムを搭載したSIM²により、従来のSIM解像度を2倍にすることができます。Lattice SIM²の優れた焦点面以外の光を抑制する機能により、散乱光の激しい試料でも、広視野で極めて鮮明なセクショニングが可能になります。SIM²の画像再構築技術は、生体試料や固定された試料に対して、Elyra 7の構造化照明ベースの取得データを最小限のアーティファクトで正確に再構築します。

実験をスピーディーかつ効率的に

LatticeSIM²は、従来SIMの2倍のSIM解像度を実現する一方で、生体試料と固定された試料に対して最大255 fpsの速度かつ低ダメージなイメージングを実現します。また、SIM²をバーストモードおよびリープモードと組み合わせることで、かつてない高速な超解像取得が可能となります。SIM Apotomeモードでは損失のない取得を実現し、データ再構築に必要なオリジナルデータはそれぞれのフレームで1枚だけです。Elyra 7 Duolinkで2つの異なる染色を同時にイメージングし、多色で、解像度を向上させることも可能です。

 

Cos-7細胞の小胞体(カルレティキュリン-tdTomato)のタイムラプスイメージングにより、極めて動的な構造変化が明らかに。

SMLM:アフリカツメガエルA6細胞(上皮腎臓細胞)。
SMLM:アフリカツメガエルA6細胞(上皮腎臓細胞)。

研究に柔軟性を

Elyra 7は、C. elegans、および厚さ最大100 µmの植物または組織切片の光感受性の高い培養細胞といった、あらゆる試料タイプに対応します。Lattice SIM²、SIM² Apotome、広視野DIC、SMLMおよびTIRFなど、Elyra 7は複数の顕鏡方法を搭載しています。これらの技術をすべて、あるいは一部使用して取得した同じ試料画像を相互に関連付けることで、試料からより深い知見を得ることができます。また、Elyra 7をAiryscan搭載のLSMや走査型電子顕微鏡など、他の様々なイメージングシステムと組み合わせ、相関ワークフローを形成することも可能です。

バックグラウンドテクノロジー

Lattice SIM:3D超解像生細胞イメージング

Lattice SIMでは、従来のSIMのように、試料領域はグリッド線ではなく格子スポットパターンで照射されます。これによりイメージング速度が劇的に向上します。さらに、高いコントラストを実現する格子パターンが正確な画像再構築を可能にします。従来のSIMと比較して格子パターン照明の効率は2倍アップし、試料照明に必要なレーザー照射量は少なくて済みます。これこそがLattice SIMが生細胞イメージングに好ましい技術である所以です。大幅に改善された格子照明の光量子効率のおかげで、より高いコントラストとより低い光照射量を実現しながら、イメージング速度を上げることが可能となります。

 

SIM²:SIM解像度を2倍に

Cos7細胞のAlexa fluor 488 で染色されたαチューブリンデータを、一般的なウィーナーフィルターを使用した従来のSIMアルゴリズムと、新しいSIM²再構成で処理。
Cos7細胞のAlexa fluor 488 で染色されたαチューブリンデータを、一般的なウィーナーフィルターを使用した従来のSIMアルゴリズムと、新しいSIM²再構成で処理。画像から、SIMと比較してSIM²の解像度が改善していることが分かる。対物レンズ:Plan-Apochromat 63× / 1.4 油浸

SIM²は、構造化照明顕微鏡データの解像度とセクショニング品質を向上させる、斬新で画期的な画像再構築アルゴリズムです。SIM²は、Elyra 7のすべてのSIMイメージングモードと互換性があり、ZENソフトウェアに完全に統合されています。

従来の再構築アルゴリズムとは異なり、SIM²は2段階の画像再構築アルゴリズムです。初めに次数の組み合わせ、ノイズ除去、および周波数抑制フィルタリングがまず実行され、 デジタル画像操作から生じるすべてのエフェクトが、デジタルSIM点像分布関数(PSF)に変換されます。その後のデコンボリューションでこのPSFが使用されます。ハードウェアベースの顕微鏡データのデコンボリューションでの実験的PSFの使用と同様に、SIM²アルゴリズムは解像度、セクショニング、および確実性の面で、従来のワンステップ画像構築法よりも優れています。

従来の染色試料のマルチカラー超解像イメージング

Lattice SIM²では、従来の方法で染色された試料に対して、60 nmまでの解像度でマルチカラーイメージングを実行できます。サイズが小さいため、シナプトネマ複合体の3色イメージングは、これまではthree-fold expandedの超解像イメージングといった複雑な手法でしか実現できませんでした。しかしLattice SIM²は、SYCP3(lateral elements)の2つのストランドとSYCP1-C(C-terminus of transverse filaments)を、特殊な試料処理や特殊な染色なしに100 nmをはるかに下回る解像度でイメージングできます。さらに、3色画像はタンパク質SYCP3とSYCP1の距離に関する構造情報も提供できます。SYCP1タンパク質内でも、異なるマークが施されたN末端とC末端は、2つのマーク間で50 nm未満の解像度で明確に分離することができます。

マウス精巣の3重マークシナプトネマ複合体の構造
YCP3をSeTau647で、SYCP1-CをAlexa 488で、SYCP1-NをAlexa 568で、Lattice SIM²モードでマウス精巣の3重マークシナプトネマ複合体の構造を可視化。

初めて結果を見たときのことは忘れません。ただ驚いてしまって、笑うことしかできませんでした。次に、この顕微鏡をすぐに活用できそうな人々にメールをしました。組織神経生物学者、細胞および分子免疫学者、酵母や細菌を扱う人々までがすでにSIM²のメリットを得ています。

Peter O‘Toole, Head of Imaging and Cytometry, University of York

SIM Apotome:柔軟な光学セクショニング

SIM Apotome
Widefieldシステムを使用した生細胞イメージングでは、ピンぼけやバックグラウンドシグナルの問題があることが知られており、 画像のコントラストと解像度が低下してしまうことがあります。Elyra 7のSIM Apotomeモードは、構造化照明で鮮明なコントラストとxy方向およびz方向の高い解像度を備えた、高速光学セクショニングを実現します。

SIM² Apotome
SIM²再構築アルゴリズムと組み合わせたSIM Apotomeモードを使用すると、高いコントラストや解像度はそのままに、生細胞イメージングをさらに低ダメージに、高速に実施できます。あるいは、さらに高速化した光学セクショニングで大規模な試料領域を様々な倍率で取得し、大量の試料を取得する際の生産性を向上させることができます。

SIM² Apotome:WidefieldとSIM2単一平面画像での比較。 Cos7微小管(αチューブリン-Alexa Fluor 488、緑)核(Hoechst、青)。対物レンズ:LD LCI Plan-Apochromat 25× / 0.8 Imm Corr

可能性を拓く

単一分子局在顕微鏡

分子解像度での3Dイメージング

単一分子局在化顕微鏡法(SMLM)では、蛍光分子がまばらに活性化されるため、1つの蛍光分子のみが単一点像分布関数(PSF)内でオン状態になります。これにより、PSFの拡張をはるかに超えるローカリゼーション精度で重心を決定することができます。記録されると分子はオフ状態になり、すべての分子が捕捉されるまで活性化/非活性化のサイクルが繰り返されます。新しい画像で局在がプロットされて超解像画像が作成されます。Elyra 7では、PALMdSTORMPAINTなどのSMLM技術で20〜30 nmの横方向の解像度を実現でき、 ZENソフトウェアがデータの画像再構築をシームレスに実行します。

さらに、Elyra 7にはPRILMテクノロジーを採用した3D SMLMモードが備わっています。PSFはZ位置をエンコードするために再形成されているため、1つの平面のみを取得しながら、50~80 nmの軸方向解像度で深度1.4 µmのボリューム情報を取得します。それにより、一貫した分子精度で細胞全体から3Dデータを取得できます。

BSC1(腎臓上皮細胞)のミトコンドリア膜:3D PAINTイメージ
BSC1(腎臓上皮細胞)のミトコンドリア膜:3D PAINTイメージ

Elyra 7 Duolink

同時2色イメージング

生体試料の研究では、様々なタンパク質や細胞小器官の相互作用に注目することがよくあります。ダイナミックなプロセスを深く理解するには、関連構造の同時イメージングは欠かせません。Elyra 7にDuolinkアダプターにより2台のsCMOSカメラを搭載することで、Wide-Fieldベース手法の利点を活用することができます:

  • スキャンベースのテクノロジーの使用時や異なるチャネルの連続データ取得中に起こりがちな遅延がなく、視野全体で同時2色イメージングを実行
  • 短い露光時間で、生細胞全体の超解像リアルタイムスナップショットを取得
  • 同時間内に取得する情報の量を2倍にすることで、固定細胞観察の生産性が向上
  • 統合したマルチバンドパスエミッションフィルターが可能にする最小限のシグナルクロストークにより、2台のカメラで色の組み合わせをイメージング
  • 4色イメージ撮影時メカニカルフィルタの交換が不要。マルチカラーイメージングをさらに高速化
  • 2台のsCMOSカメラによるマルチカラーSMLM実験
2色同時取得用Elyra 7 Duolink sCMOSカメラアダプター
効率的な画像取得のために搭載されたマルチバンドパスエミッションフィルターキューブを備えた、2色同時取得用Elyra 7 Duolink sCMOSカメラアダプター
 

小胞体マーカーであるカルレティキュリン-tdTomato(マゼンタ)と、ミトコンドリアマーカーであるTomm20-mEmerald(緑)を発現するCos-7細胞を2色で同時にイメージング。小胞体とミトコンドリアの動的な相互作用

バーストモード

最大255 fpsの超解像イメージング

細胞内の小さな小胞の拡散性、特に弾道性の動きは、超解像とダイナミックなイメージングが同時に可能である場合にのみ取得できます。またElyra 7は、2Dタイムラプスデータのバースト処理により広視野で255 Hzの超解像画像を生成し、Lattice SIMとSIM Apotomeの両方のモードで2色同時取得が可能です。

 

Rab5-mEmerald(緑)とtdTomatoタグ付きゴルジ関連移動マーカー(マゼンタ)を発現するU2OS細胞。1024×1024ピクセル(64 µm×64 µm)のFOVに対して、1.5 ms /フェーズの露光時間での同時デュアルカラー取得。

リープモード

3倍の速度の3Dイメージングのためのデジタルセクショニング

Elyra 7のリープモードは、ボリュームイメージング速度を3倍に加速すると同時に、試料への露光量を減少します。カルレティキュリン-tdTomatoを発現するU2OS細胞の全ボリューム(18面)は、細部をすべてキャプチャしながら、LatticeSIM取得モードで38ボリューム/分の速度でイメージングされました。またSIM Apotome取得モードの場合、最大3倍のボリュームイメージング速度が期待できます。

 

小胞体を可視化するためのカルレティキュリン-tdTomatoを発現するU2OS細胞。タイムラプスイメージング・最大輝度値投影法にて表示。

アプリケーション

ZEISS Elyra 7のアプリケーション例

細胞骨格の構成要素の研究

アクチンネットワークや微小管フィラメントなど細胞骨格成分の微細構造により、100 nmよりはるかに小さいイメージングでは、超解像技術がよく利用されます。Lattice SIM²は、従来のSIM技術と比較して試料からはるかに多くの構造情報を取得し、 60 nmまでの解像度で観察するだけでなく、セクショニング品質を大幅に改善します。

ファロイジンAlexa 488でラベルされたCos-7細胞のLattice SIM²画像
ファロイジンAlexa 488でラベル付けされたCos-7細胞のLattice SIM²画像。Plan-Apochromat 100× / 1.57油浸対物レンズで取得。Zスタックの最大輝度値投影法にて表示。
Cos 7細胞:αチューブリン(Alexa 488)、カラーコードプロジェクションで表示。
Cos 7細胞:αチューブリン(Alexa 488)、カラーコードプロジェクションで表示。これらの画像は、SIM²画像再構成アルゴリズムの優れたセクショニング機能を示す。対物レンズ:Plan-Apochromat 63× / 1.4 油浸

生物学的プロセスを理解する

独自の格子構造化照明により、Elyra 7は高速イメージングと卓越した光効率、低ダメージ、さらに感度を実現します。これにより、生体試料の細胞、細胞内部、さらには細胞小器官の構造を2D・3Dで経時的に観察できます。ミトコンドリアの動き、融合と分裂、または小胞体の出芽の動態など、Elyra 7 Lattice SIM²は超解像での生細胞イメージングを提供します。

 

Tomm20-mEmeraldを発現するU2OS細胞。対物レンズ:Plan-Apochromat 63× / 1.4 油浸

 

Cos-7細胞における小胞体(カルレティキュリン-tdTomato、マゼンタ)と微小管(EMTB-3xGFP、緑)の同時イメージングにより、これらの細胞小器官の動的な相互作用が明らかに。対物レンズ:Plan-Apochromat 63× / 1.4 油浸

驚異的な速度の優れたセクショニング

SIM² Apotomeは、最も高い空間分解能を必要とせず、優れたセクショニング品質が求められる実験向けのフレキシブルな生細胞イメージングの方法です。横方向および軸方向の解像度、ボリューム取得速度の点で従来の共焦点顕微鏡よりも優れており、試料にとっても非常に低ダメージな方法です。高NA(1.4)の倍率40倍の画像は、従来のSIM顕微鏡と同程度の解像度とセクショニング機能、および高速の取得速度を実現しています。

 

H2B-mCherry(マゼンタ)およびα-Tubulin mEmerald-GFP(緑)を発現するLLC PK1細胞のSIM² Apotomeタイムラプスデータ。深度3.7 µmにわたる12面の最大輝度値投影画像。対物レンズ:LD LCI Plan-Apochromat 25× / 0.8 Imm Corr

 

小胞体マーカーであるカルレティキュリン-tdTomatoを発現するCos-7細胞のSIM² Apotomeタイムラプスデータ。深度1.4 µmにわたる12面の最大輝度値投影画像。対物レンズ:Plan-Apochromat 40× / 1.4 油浸

広い領域の高速タイルスキャン

SIM Apotome取得モードの高速パフォーマンスにより、非常に広い領域の高速タイルスキャンイメージングを優れたセクショニング品質で実現できます。11.1 mm²×11 µmサイズの桑の切片は、ナイキストサンプリングで2分以内に3方向すべてと2色でイメージングされています。葉の断面でも同様の速度を達成することができました。

 

EC Plan-Neofluar 10x / 0.3対物レンズを使用した薄い桑の切片のSIM²Apotomeボリュームタイルスキャン画像。11 µmの深さにわたる最大輝度値投影法。試料:TS-Optics Set Dauerpräparate Botanik 25Stの「Maulbeere」。

 

EC Plan-Neofluar10x / 0.3対物レンズでイメージングした葉の断面のSIM² Apotomeボリュームタイルスキャン画像。Zスタックの最大輝度値投影法。試料:TS-Optics Set Dauerpräparate Botanik 25Stの「葉」。

スピードと解像度のニーズを定義

より高速なイメージング速度と低ダメージのニーズは無限にあります。Elyra 7構造化照明パターンと画像再構築ソフトウェアの堅牢性により、解像度をわずかに低下させながら、LatticeSIMとSIMApotomeの両方の取得モードに必要な位相画像の数を大幅に削減できます。LatticeSIM取得は、1フレームあたり9フェーズの画像で、SIM Apotomeでは1フレームあたり3フェーズの画像で十分であり、イメージング速度がそれぞれ44%と66%向上します。

 

EMTB-3xGFP(緑)とEB3-tdTomato(マゼンタ)を発現するCos-7細胞。微小管の動的な動きを示す。Lattice SIM9フェーズモードでイメージング。

 

LifeAct-tdTomatoを発現するCos-7細胞のアクチンダイナミクスを、SIM Apotome 3Dリープモードで経時的にイメージング。

深部に隠れている細部を解明

構造化照明ベースの顕微鏡であるにもかかわらず、Elyra 7 Lattice SIM²およびSIM² Apotomeは、厚い試料または拡散試料で超解像および高品質のセクショニングを提供することができます。確実な照明パターンと優れた画像再構成技術の組み合わせにより、神経マーカーであるThy1-eGFPを発現する厚さ約80 µmのマウスの脳切片全体のイメージングに成功しました。

ニューロンマーカーThy1-eGFPを発現するマウスの脳を、75 µmのZスタック範囲にわたってLattice SIMモードでイメージング。
ニューロンマーカーThy1-eGFPを発現するマウスの脳を、75 µmのZスタック範囲にわたってLattice SIMモードでイメージング。
血管マーカーfli1-EGFPを発現するゼブラフィッシュ胚を、100 µmの範囲でSIM Apotomeモードでイメージング。
血管マーカーfli1-EGFPを発現するゼブラフィッシュ胚を、100 µmの範囲でSIM Apotomeモードでイメージング。

生体の多様性を発見する

Elyra 7 Lattice SIM²、SIM² Apotome、またはSMLMモードで、生きた、または固定された、大小様々な厚みの試料を観察できます。細胞や酵母の小胞動態の研究にも、植物、線虫、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、バクテリアの構造の解明にも、Elyra 7でモデル生物などの様々な試料の超解像イメージングが可能です。

 

C.エレガンス幼虫のLattice SIM²の3D画像。最大強度の投影画像。試料ご提供:Mango Lab (University of Basel, Switzerland)

 

GFP結合膜マーカーとmCherry結合ゴルジ関連タンパク質を発現する酵母のLattice SIM²タイムラプス画像。試料ご提供:C. MacDonald, G. Calder & P. O’Toole (Department of Biology & Bioscience Technology Facility, University of York, UK)

 

SIM2 Apotome 3D画像:シロイヌナズナの葉の。上部3つの細胞層の微小管(チューブリン-GFP)。試料・データご提供:G. Calder and P. O’Toole (Department of Biology & Bioscience Technology Facility, University of York, UK)

 

SIM² Apotome:血管マーカーfli1-EGFPを発現するゼブラフィッシュ胚の3Dイメージング。Z-スタック・タイルスキャンデータセットの最大輝度投影。試料ご提供:Haass Lab (MCN, University of Munich, Germany)

様々なスケールで観察

生物学的試料には、長さスケールの異なるタイプの情報が含まれていることがよくあります。同じ試料を基に低倍率から高解像度のデータを取得できると、生産性を改善することができ、結果を相互に関連付け、考慮し、全体像を把握できます。

ニューロンマーカーThy1-eGFPを発現するマウス脳のSIM² ApotomeおよびLattice SIM²画像。ボリュームデータのカラーコードまたは最大強度の投影画像。
ニューロンマーカーThy1-eGFPを発現するマウス脳のSIM² ApotomeおよびLattice SIM²画像。ボリュームデータのカラーコードまたは最大強度の投影画像。
ニューロンマーカーThy1-eGFPを発現するマウス脳のSIM² ApotomeおよびLattice SIM²画像。ボリュームデータのカラーコードまたは最大強度の投影画像。

ニューロンマーカーThy1-eGFPを発現するマウス脳のSIM² ApotomeおよびLattice SIM²画像。ボリュームデータの色分けされたまたは最大強度の投影画像。

単一分子局在化顕微鏡(SMLM)

SMLMには、PALM、dSTORM、PAINTなどの技術が採用されています。Elyra 7は、可視光全体にわたる高出力レーザーとデュアルカメラ検出により、幅広い色素、マーカーと蛍光タンパクでの可能なほぼ全ての組み合わせを提供します。

分子構造の解明

SMLMは、個々のタンパク質の正確な位置をマッピングできます。
 

SMLM:A6細胞における核膜孔複合体の8回対称性。
SMLM:A6細胞における核膜孔複合体の8回対称性。

分子間の関係を同定

分子レベルの精度で2つのチャネルを検出します。
 

SMLM:αチューブリンはAlexa 555で、βチューブリンはAlexa 488でラベル。
SMLM:αチューブリンはAlexa 555で、βチューブリンはAlexa 488でラベル。

3次元情報を取得

Z方向の分子関係を確実に解き明かします。

SMLM:1.4 µmの深度を一度で取得。
SMLM:1.4 µmの深度を一度で取得。

ダウンロード

Lattice SIM²搭載ZEISS Elyra 7

かつてない解像度を誇るライブイメージングシステム

ページs: 33
ファイルサイズ: 6330 kB

Technology Note

Super-Resolution Imaging by Dual Iterative Structured Illumination Microscopy

ページs: 19
ファイルサイズ: 6578 kB

Introducing Lattice SIM for ZEISS Elyra 7

Structured Illumination Microscopy with a 3D Lattice for Live Cell Imaging

ページs: 8
ファイルサイズ: 1249 kB

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