3Dイメージングと光学セクショニング

3Dイメージング

研究をサポートする幅広いイメージングソリューション

細胞小器官からバクテリア、体細胞層、組織切片、小型モデル生物に至るまで、すべての試料は3次元です。 蛍光顕微鏡法は、特定のタンパク質、構造、細胞小器官を標識する強力な手法です。 しかし、試料内の上記のような対象物の画像化を行う場合、焦点面の上下両方向への蛍光放射が起こり、それが対物レンズに捉えられてしまいます。 これによって、結果の画像がぼやけてしまい、解像度が低くなってしまいます。 光学セクショニングのような最先端の3Dイメージング手法を利用することによって、蛍光試料から明瞭な3次元画像を得ることができます。 一般的な3Dイメージング技術では、焦点面以外の蛍光をなくすか最小限に抑えるために、数学的アルゴリズムか光学系ハードウェア、あるいはその両方を利用します。

光学顕微鏡での光学セクショニング用3Dイメージング技術

  • デコンボルーションは、数学モデルを利用した3Dイメージング手法です。 デコンボルーションは、迷光を元の場所に数学的に再割り当てすることにより、ぼやけた画像を復元します。 この光学セクショニング手法は、焦点面の光、焦点面以外の光の両方を使うためとても高感度で、微弱蛍光サンプルや生組織の画像化に最適です。 ZENのデコンボルーションモジュールを利用して、様々な蛍光イメージに光学セクショニングを利用することができます。
  • ApoTome.2を用いた構造化照明は、焦点面に投影され、非常に正確に動作するグリッド構造に基づいています。 特許アルゴリズムが、グリッド位置の異なる3枚の画像から高解像光学セクショニングを算出します。 組織切片や動物全体のマルチチャネル3Dイメージ取得をお試しください。 ZEISS 顕微鏡の視野絞り位置にApoTome.2を取り付けるだけで、すばらしい3D画像が得られます。
  • 共焦点レーザスキャン顕微鏡は、点照明と蛍光路の共役平面内のピンホールを利用して、焦点面以外の光を抑制します。 この技術は厚みのあるサンプルに対する強力なツールとなり、Z方向で高い解像度を得ることができます。 しかし、光をあまり出さない暗い試料の観察は難しくなります。 ZEISS 共焦点レーザスキャン顕微鏡LSM 800LSM 880は、最大45%にもおよぶ量子効率をもった超高感度検出器を備えています。 困難な試料でさえも、優れたSN比と短い露光時間で画像化することができます。 生体試料を少ない光ダメージで高速にイメージングするには、Cell Observer SDをご利用ください。 ☆この3Dイメージングソリューションの特徴は、回転ディスクです。 回転するディスク上の複数のピンホールによって、3D共焦点画像を高速に取得することができます。
  • 選択的励起とは、光学セクショニングを作成するために、目的の焦点面にある蛍光色素分子のみを励起することです。 これは、LSM 880 NLOや、LSM 800または880のNLOアドオンを使って多光子顕微鏡観察を行うことで実現できます。 赤外領域の低エネルギー波長を使うと、蛍光色素分子を励起するために2つの光子が必要になります。 蛍光は主にレーザビームが強く集束される焦点面内で発生します。 さらに、長い励起波長が利用されるため、散乱と光による損傷が軽減できます。 褪色と光毒作用を避けつつ、1ミリという今までにない深さでの画像の取得が可能となります。 選択的励起を利用したもう1つの技術が、ライトシート顕微鏡(LSFM)です。 励起光路は蛍光路から分離され、シート光が試料の焦点面のみを照らします。 Lightsheet Z.1はマルチアングルイメージングとインキュベーションを特徴としており、胚や生命体の発生過程を数時間にわたって簡単に観察することができます。数日にわたるイメージングさえも可能です。

3D超解像顕微鏡

超解像構造化照明顕微鏡法(SR-SIM)は、3D取得を実現する万能で柔軟なイメージング技術です。 高精度な干渉レーザ光の位相格子がサンプルの上で回転、移動し、蛍光分子を励起します。 サンプルの構造パターンに干渉することによって、重ねあわされた照明パターンが3つ目のパターンを作り出します。 これは、サンプルの微小構造から発生する詳細なパターンよりも広いため、レンズを通ることが可能です。 その後、超解像イメージがその情報から計算されます。 このようにして、XY 分解能、そしてとりわけ Z 分解能を上げることができます。 ELYRA S.1ELYRA PS.1を使えば、従来の試料ですばらしい3D画像の結果を得ることができます。 光学顕微鏡の解像度を倍増し、Z軸セクショニングを行うことが可能です。

電子顕微鏡での3Dイメージング

走査電子顕微鏡には、生物の微細構造をすばらしい解像度で3Dイメージングと組み合わせることができる画像化能力があります。 試料は樹脂の中に埋め込まれ、その後試料チャンバ内でウルトラミクロトームを使って物理的にスライスされます。 試料のブロックはスライスされた後に画像化され、一連の電子顕微鏡イメージが生成されます。これを再び組み合わせることによって、最終的な3Dデータセットを得ることができます。 この技術はシリアルブロックフェイスイメージング(SBF-SEM)とも呼ばれています。ZEISS 走査電子顕微鏡MERLIN 3ViewSIGMA 3Viewでは、Gatan社の高速で便利なSBF-SEM技術を活用してこれを実現しています。 もう1つの可能性は、集束イオンビームを利用する方法です。これは ZEISS クロスビームFIB-SEMワークステーション で使用されており、試料の表面を切削してATLAS 3Dソフトウェアで再構築しています。 ウルトラミクロトームによるアプローチの方が高速ですが、集束イオンビームの方が薄くスライスすることができます。

このチュートリアルは、緑の疑似カラーの試料の顕微鏡像が「Widefield Image」ウインドウに、グレースケールの同じイメージが「Raw Image」ウインドウに表示されるところから始まります。 「AutoPlay」ボタンを押すか、マウスカーソルを使っていずれかの「Modulation Angle」をクリックするとチュートリアルを操作できます。 様々な角度のグリッドが「Raw Image」に重なって表示され、関連するパワースペクトルが「Fourier Spectrum」ウインドウに表示されます。 5つすべての画像を取得すると、再構成された高解像イメージが「Superresolution-SIM Image」ウインドウに表示されます。

 

チュートリアル: 超解像構造化照明顕微鏡
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