スペクトルイメージングアプリケーション用推奨顕微鏡システム

スペクトルイメージング

蛍光色素のスペクトル情報から近接波長を明瞭に分離します

蛍光標識やフィルタ、画像取得法を慎重に選択すれば、ほとんどの蛍光イメージングアプリケーションで優れた結果を得ることができます。 しかし、ほとんどの場合、撮影パラメータの選択には制限があります。 多重標識の生細胞観察では、常にはっきりと区別できるスペクトルと蛍光プローブを利用できるとは限りません。 さらに、本来備わっている自家蛍光によって、アーチファクトが発生する可能性もあります。 定着剤やDNAトランスフェクション試薬の利用によってある点の自家蛍光が増加し、その点の自家蛍光がスペクトル画像の信号を上回ってしまう可能性さえもあります。 この種の問題を回避するには、リニアアンミキシングと組み合わせたスペクトルイメージングによって蛍光シグナルを分離し、各蛍光色素の空間への関与をより明確にします。 このスペクトルイメージング技術は、エミッションフィンガープリント法とも呼ばれています。

スペクトルイメージング - 分光法とイメージングの融合

スペクトルイメージングによって、分光法とイメージングという2つの確立された技術を融合することができます。 このアプローチによってlambdaスタックを得ることができます。lambdaスタックは、それぞれが狭い帯域幅の波長によって計測された画像の集合とみなすことができます。 ZEISS の共焦点レーザスキャン顕微鏡LSM 800は、VSDビームスプリッタによってlambdaスタックの連続取得を実現しています。 LSM 880では、検出チャネルの直線配列を使って、複数のスペクトル画像を同時に得ることさえもできます。 革新的なQUASAR検知器では、最大34チャネルまでの同時読み出しが可能です。 こうして1回のスキャンでlambdaスタック全体を取得し、光毒性を最小限に抑えることができます。 さらに、ノイズを徹底的に抑制できるため、高度な処理技術を適用することもできます。 各チャネルの情報は、さらに解析を行うときのために保持されています。

リニアアンミキシング - スペクトルフィンガープリントの分離

試料から収集したスペクトル情報の合計は、リニアアンミキシングによって各蛍光色素についての個々の画像へと分離されます。 これは、lambdaスタックの各ピクセルからのスペクトルの内容と、試料が示している蛍光色素の既知スペクトルのすべての可能な組合せを比較するアルゴリズムによって行われます。 結果の処理や解釈、プレゼンテーションには、ZENデジタルイメージングソフトウェアで実装されている専用ソフトウェアパレットが利用できます。
スペクトルイメージングとリニアアンミキシングによって、分光による染色体解析、免疫蛍光、生細胞イメージング、創薬、組織病理学における問題解決が可能になります。 大幅にスペクトルオーバーラップが起きている状況であっても、様々な種類の吸収色素や蛍光色素分子を検出して差別化することができます。 これは、FRET調査で目にする複雑なシグナルを定量化する際に特に役立ちます。 自家蛍光は、関心のあるシグナルから分離するために別個の蛍光色素として扱うことができます。

このチュートリアルは、EGFP(赤の曲線)とAlexa Fluor 488(緑の曲線)の50:50の混合による合計スペクトル(黒の曲線)がスペクトルウインドウに表示されるところから始まります。 各プローブ(li(?))の波長の関数(l(?))としての合計明度への関与の強度が、グラフの下に表示されています。 「Fluorophore A」と「Fluorophore B」のスライダを使って、蛍光色素分子AとBの関与度をゼロから100パーセントの範囲で調整できます。 プルダウンメニューを使って、同じ色領域で異なる蛍光色素分子を選択することもできます。 一番下のプルダウンメニュー(Fluorophore C)で3つ目の蛍光色素を選択すると、3つのコンポーネントを持った合計スペクトルを調べられるようになります。 3つのコンポーネントモデルの特定の蛍光色素分子の関与度は、スライダの左側の鍵アイコンをクリックしてロックすることができます。 いずれかの蛍光色素分子がロックされると、残りの2つの蛍光色素分子の関与度が変更できるようになります。

さらに詳しい情報については、ZEISS オンラインキャンパスをご覧ください。

チュートリアル: エミッションスペクトルの特性
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